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液氮罐內(nèi)體細(xì)胞的凍存和再生原理是什么?

時間:2020-12-22 14:13來源: 作者:ydgmve2020yyx 點(diǎn)擊:
一、基本原理 在不用一切標(biāo)準(zhǔn)下立即凍存體細(xì)胞時,體細(xì)胞內(nèi)和外自然環(huán)境中的水都是產(chǎn)生冰晶,能造成體細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生機(jī)械設(shè)備損害、電解質(zhì)溶液上升、血漿滲透壓更改、脫干、PH更改

  一、基本原理 在不用一切標(biāo)準(zhǔn)下立即凍存體細(xì)胞時,體細(xì)胞內(nèi)和外自然環(huán)境中的水都是產(chǎn)生冰晶,能造成體細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生機(jī)械設(shè)備損害、電解質(zhì)溶液上升、血漿滲透壓更改、脫干、PH更改、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)性等,能造成體細(xì)胞身亡。如向細(xì)胞培養(yǎng)液添加保護(hù)膜,可讓冰度減少。

  在遲緩的凍潔標(biāo)準(zhǔn)下,能使體細(xì)胞內(nèi)水分在凍潔前顯出體細(xì)胞。存儲在-130℃下列的超低溫里能降低冰晶的產(chǎn)生。 體細(xì)胞再生時速率要快,使之快速根據(jù)體細(xì)胞容易損傷的-5~0℃,體細(xì)胞仍能生長發(fā)育,魅力損傷并不大。 現(xiàn)階段常見的保護(hù)膜為二甲亞砜(DMSO)和凡士林,他們對體細(xì)胞不含毒性,含量小,溶解性大,易透過體細(xì)胞。

  二、操作流程 (一)凍存

  1、消化吸收體細(xì)胞(同試驗(yàn)二),將體細(xì)胞懸浮液搜集至離心管中。

  2、1000rpm抽濾10分鐘,棄上清液。

  3、沉定加含維護(hù)液的塑造,記數(shù),調(diào)節(jié)至5×106/ml上下。

  4、將懸液分至凍銀行存管中,每管1ml。

  5、將凍銀行存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火苗密封,密封一定要嚴(yán),不然再生*易出現(xiàn)崩裂。

  6、貼標(biāo)簽,注明體細(xì)胞類型,凍存時間。凍銀行存管外拴一金屬材料吊物和一輕繩。

  7、按以下次序減溫:室內(nèi)溫度→4℃(20分鐘〕→電冰箱冷藏室(30分鐘)→低溫箱(-30℃1鐘頭)→汽態(tài)氮(30分鐘)→液態(tài)氮。 留意:實(shí)際操作時要當(dāng)心,以防液態(tài)氮凍傷。液態(tài)氮定期維護(hù),隨時隨地填補(bǔ),絕對不可以蒸發(fā)整潔,一般30立升的液態(tài)氮可用1~1.5月。

  (二)再生

  1、提前準(zhǔn)備一個茶缸或1000ml的燒毀,內(nèi)窗2/3杯37℃的溫開水。

  2、從液態(tài)氮中取下凍銀行存管、快速放置溫開水中并持續(xù)攪拌。使凍銀行存管中的凍存物在1分鐘以內(nèi)溶化。 3、開啟凍銀行存管,將體細(xì)胞懸浮液吸進(jìn)離心管中。

  4、1000rpm抽濾10分鐘,棄去上清液。

  5、沉定加10ml細(xì)胞培養(yǎng)液,吹打勻稱,再抽濾10分鐘,棄上清液。

  6、加適度培養(yǎng)液后將體細(xì)胞遷移至塑造瓶中,37℃塑造,第二天觀查生長發(fā)育狀況。

  三、實(shí)驗(yàn)試劑和器械 器械:液氮罐、凍銀行存管(塑膠螺旋燈專用型凍銀行存管或安瓿瓶)、離心管、塑料吸管、離心脫水機(jī)等 實(shí)驗(yàn)試劑:0.25%胰酶、培養(yǎng)液、含保護(hù)膜的培養(yǎng)液(即凍存液) 附:凍存液配置: 培養(yǎng)液添加凡士林或DSMO,使其終濃度值達(dá)5—20%。保護(hù)膜的類型和使用量視不一樣體細(xì)胞而不一樣。選好后4℃下儲存。

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